“玩转离心机”离心protocol有奖征集活动火热进行中-yb体育官方

称取适量乳粉，加入甲醇，水以及0.1%三氯乙酸混合提取液，定容至50ml,用离心机反复离心，至溶液澄清，取5ml澄清液用无水乙醇，反复旋转蒸发，除去水分，后加入硅烷化试剂5ml，水浴70度反应70分钟，后冷却，加入5ml正己烷提取，再离心至分层明显，取上清液进样。

我实验室使用的是贝克曼台式低温离心机。将复苏后的肝细胞混悬液置于离心管中以140000 g (相当于 34000 rpm/min ）4℃ 离心 24 h 去掉上清即可得到肝细胞中的微粒体。

在提取多糖多酚较多的植物总rna时，加入提取液后离心，需要去除蛋白及dna，在抽取上层时宁少勿贪多。移液器操作要特别注意：吸力不要过大，以防搅拌中间层及下层液体而引起污染。

1、肌原纤维蛋白的提取

肉样品，用5倍的提取缓冲液（0.1m nacl，2 mmol/l mgcl2，1 mmol/l edta，10 mmol/l k2hpo4，ph 7.0）匀浆后离心（2000 g，10min），重复四次并在第四次离心前用四层纱布过滤并用0.1m的hcl将ph调至6.0，最后得到的蛋白膏保存于冰盒中备用。蛋白浓度用双缩脲法测定。

2、蛋白氧化模型的制作

构建以下氧化体系：反应历程为vc fe3 →fe2 ，fe2 h2o2→⋅oh，fecl3浓度为0.01mmol/l，抗坏血酸浓度为0.1mmol/l，h2o2浓度分别为0.5、1、5、10、20 mmol/l。肌原纤维蛋白分散于上述氧化体系中（最终质量浓度为40 mg/ml），在4℃条件下氧化24h后用1 mmol/l 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，edta ） edta ） 终止。以上的氧化反应均在15 mmol/l 哌嗪-n,n''''''''''''''''-双（2-乙磺酸）（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，pipes）0.6 mol/l的nacl为缓冲溶液（ph 值6.0）中进行。空白对照为新鲜猪背最长肌中提取出来后，未加氧化剂直接于4℃放置24 h 的肌原纤维蛋白（在本试验中将h2o2 浓度定义为0）。

3、羰基值的检测

在1.5 ml的离心管中，加入0.1 ml的蛋白溶液与0.5 ml 2,4-二硝基苯肼的2 mol/l hcl 溶液，在25℃下反应40 min，空白样品中不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/lhcl。然后加入0.5 ml 质量分数为20%的三氯乙酸（trichloroacetic acid, tca），震荡后离心（11 000×g，5 min）弃上清，蛋白沉淀用2 ml 的乙醇-乙酸乙酯溶液（体积比为1:1）离心（11 000×g，5 min）洗涤3 次，挥发完溶剂后将蛋白质悬浮于1 ml 6 mol/l 盐酸胍溶液（用0.1m hcl调节ph至2.3）中，在37℃条件下水浴保温30 min。以空白为对照370 nm下测吸光值，蛋白质羰基衍生物的含量（nmol/mg•蛋白）使用摩尔吸光系数为22 000 l/(mol•cm)计算。蛋白浓度在溶解于盐酸胍后再次检测。

在使用淋巴细胞分离液分离全血或骨髓时，除了一定转速和离心时间外，还可以通过调节离心前后的提升速度来使分层更明显。通过反复试验证明，离心开始升速时，调节为7档;离心时间到开始降速时，调节为slow档，结果与升max降max相比，分层清晰明显很多。我实验室使用的是贝克曼台式低温离心机。

1)将商品化fbs于4℃融化并分装。
2)将上述fbs分装到超速离心管（cat: #355618，beckman）中，每管25 ml，100,000 g × 14-16 h（optimal-100xp；rotor：70-ti；beckman），4℃。
3)离心后从超速离心管中轻轻取出，切勿摇动，利用移液器将90%上清液吸出到50 ml新无菌离心管（corning）中。
注：不要倾倒，利用移液器贴着液面吸取，以避免搅动底部沉淀，剩余10%可用于细胞冻存或普通细胞培养实验。
4)将上述转移到新离心管中的fbs混匀后在超净台中使用0.22 μm滤器（millipore）进行除菌，将滤出液转移到新的无菌离心管中进行分装，4℃保存（短期内使用，长时间储存请放置到-20℃保存）。

50 μl样品中加入50 μl苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分震荡后，以12000 r/min离心5 min，抽提以除去体系中的蛋白，吸出上清液于另一干净的200 μl的离心管中，并加入与上清液等体积的氯仿，充分混匀后以12000 r/min离心5 min后，吸出上清液即为核酸溶液。

本实验全部操作均在贝克曼库尔特4度离心机中操作
co-ip实验详细操作方案：
待验证互作的a和b质粒共转染细胞（转染实验步骤略）约48h后收集细胞样品，用pbs轻轻洗3遍，加入lysis buffer裂解液（已加入各种蛋白酶抑制剂和0.1m dtt）600µl，冰上裂解30min，用枪头轻轻吹下细胞裂解物吸入ep管中，4℃离心机12000rpm 10min，取出约60µl上清作为阳性对照，剩余上清转移至新的ep管中，按bca法测定蛋白浓度。
预处理protein g beads：向ep管中加入琼脂糖g蛋白40µl，以及1%bsa封闭液500µl，4℃旋转摇床摇荡4h，然后beads和1%bsa混合液4℃离心10000rpm 10s，弃去上清，再加入600µl lysis buffer，4℃旋转摇床润洗10min，然后4℃离心10000rpm 10s，弃上清，加入ip一抗约3µl和至少450µg总蛋白，4℃旋转摇床过夜，然后4℃离心10000rpm 10s，小心弃上清，加入500µl lysis buffer对beads进行清洗，旋转摇床摇5min，4℃离心10000rpm 10s，最后留约20µl上清液，加入5×loading buffer 5µl，和阳性上清对照一起煮沸5min，跑sds-page，通过western blotting进行蛋白互作情况的检测。
血清分离实验方法：
由于本课题组涉及部分应用研究实验，因此常常采集动物血液样品进行相关实验的验证研究。采集来的血液一般是通过贝克曼库尔特4度离心机进行分离，首先是把采血器中的血液样品移至1.5ml离心管，然后在4度离心机中离心8000 rpm 4min，轻轻取出离心管，将上层血清移至新的ep管中，标记好编号、日期、动物种类，进行elise等后续检测。

将噬菌体悬浮液转移至适宜于 beckman sw50.1 转子（或相当型号）的一个或多个超离管中，加入 cscl 溶液（ρ=1.5 g/ml 于 sm 中），160000 g ( 36000 r/min 于 becrkman sw50.1 转子中）4℃ 离心 24 h。当离心完成后，如下面替代方案的步骤 3 和 4 所述收集噬菌体颗粒。

体外诊断试剂研发实验中试剂中间体的获得是实验的关键。研发实验过程中，高速稳定的离心机是不可或缺的得力助手。要把纳米级的试剂原料从悬浮液中离心下来可不是一件容易的事，并且在离心过程中不能对悬浮液中的蛋白造成损害，常常需要摸索最优的离心参数：转速，和离心时间等。目前，比较通用的参数是13000r/min，4℃，30min 。对于不同的试剂项目，特别是对于比较昂贵的试剂原料，离心参数还需要进一步摸索，积累。

用戊巴比妥(2%) 和水合氯醛 (4%) 复合麻醉剂 0.15ml／只腹腔注射小鼠，70%酒精消毒小鼠胸腹部，打开腹腔。麻醉成功后将小鼠仰卧固定一于解剖板上，腹部备皮、消毒，打开腹腔，翻起肝脏及肠管，暴露门静脉及下腔静脉，寻及胆管及脾静脉并结扎，持 24g 静脉套管针由门静脉穿刺， 见回血后， 固定套管， 退内针（拔出针芯，将留置针一浮管插入至门静脉分叉下端，结扎固定导管）。缓慢灌注30 ml 37℃预温 pbs。 肝脏充盈后， 剪断肝下方下腔静脉作为流出通道。 待肝脏血液被冲尽后（持续灌注8一10min），灌注预热37°c的d-hank''''s肝脏灌流液，此时可见灌流液自下腔静脉流出，肝脏由紫红色逐渐变成淡黄色，游离肝脏，完整取出肝脏后经暴露的肝静脉继续灌注d-haiik''''s液，尽量将残余血液冲干净。将肝脏移入超净工作台中，采用体外酶灌注消化法进一步消化分离肝脏组织。将游离肝脏置于平皿中，经暴露的肝静脉反复灌注预热37°c的含酶hank''''s液i (含0.05 %的胶原酶、0.1%链霉蛋白酶e溶液)15ml.（撕破肝脏被膜，轻轻抖动肝脏促使细胞脱落，37℃磁力搅拌5min(搅拌速度为200rpm/min）。（或将消化液及肝组织放入50 ml三角瓶中再次消化20-30分钟至瓶内液体不含块状物，成为均勻咖啡色细胞悬液，消化过程中使用磁珠搅拌、温度维持在37°c）。所得细胞悬液经70um（200目）滤网过滤，并用4°c的hank''''s液冲洗降低消化酶作用。
将装有肝脏细胞悬液的硅化离心管25g离心5min，去除残余的肝实质细胞, 取上清液，400g离心10min，弃上清，沉淀物为富含肝脏非实质细胞的部分。用4°c的无血清dmem培养液冲冼重悬，定容至20 ml。取2只50 ml的刻度离心管，每管加入10 ml的30% percoll液，将细胞悬液缓慢铺在30% percoll液层上方，每管10 ml 30% percoll液 10 ml细胞混悬液，2500 rpm离心20 min。吸取中间细胞悬液层入50 ml刻度离心管，加入无血清dmem培养液至50 ml,1750 rpm离心8 min，取沉淀。加入预热37°c的含血清的dmem完全培养基至10 ml。（制备 percoll 密度梯度离心液， 自上而下密度分别为 1.037 g／ml （25%） 和 1.049 g／ml （35%）。 将沉淀用 rpmi-1640 培养基重悬后， 缓慢加入已经制备的 percoll 密度梯度离心液的最上层。2700 r／min， 4℃， 离心 20 min。 离心后， rpmi-1640 培养基与 20% percoll 密度层中间， 白色分层即为 hscs层 （图 1）。 用移液器吸咀小心吸取该层， 移至含抗生素的 rpmi-1640 培养基中，2 000r／min，4℃，离心 6 min。取沉淀与 rpmi-1640 培养基 （含 10%胎牛血清） 混匀制成细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞数。

一般细胞培养用的胎牛血清fbs中也含有牛体细胞自然分泌的大量胞外微颗粒（evs，包括外泌体等），如果未能有效预先去除，将极大影响后续外泌体实验的准确性和可靠性。我们可以通过超速离心，在120,000 xg的rcf下，4℃超离过夜（18h），把血清中的各种微颗粒彻底沉淀干净。经实验验证，此方法的外泌体微颗粒残留量与商品化的无微颗粒血清相当，且对细胞培养效果无明显影响。