用戊巴比妥(2%) 和水合氯醛 (4%) 复合麻醉剂 0.15ml／只腹腔注射小鼠，70%酒精消毒小鼠胸腹部，打开腹腔。麻醉成功后将小鼠仰卧固定一于解剖板上，腹部备皮、消毒，打开腹腔，翻起肝脏及肠管，暴露门静脉及下腔静脉，寻及胆管及脾静脉并结扎，持 24g 静脉套管针由门静脉穿刺， 见回血后， 固定套管， 退内针（拔出针芯，将留置针一浮管插入至门静脉分叉下端，结扎固定导管）。缓慢灌注30 ml 37℃预温 pbs。 肝脏充盈后， 剪断肝下方下腔静脉作为流出通道。 待肝脏血液被冲尽后（持续灌注8一10min），灌注预热37°c的d-hank''''s肝脏灌流液，此时可见灌流液自下腔静脉流出，肝脏由紫红色逐渐变成淡黄色，游离肝脏，完整取出肝脏后经暴露的肝静脉继续灌注d-haiik''''s液，尽量将残余血液冲干净。将肝脏移入超净工作台中，采用体外酶灌注消化法进一步消化分离肝脏组织。将游离肝脏置于平皿中，经暴露的肝静脉反复灌注预热37°c的含酶hank''''s液i (含0.05 %的胶原酶、0.1%链霉蛋白酶e溶液)15ml.（撕破肝脏被膜，轻轻抖动肝脏促使细胞脱落，37℃磁力搅拌5min(搅拌速度为200rpm/min）。（或将消化液及肝组织放入50 ml三角瓶中再次消化20-30分钟至瓶内液体不含块状物，成为均勻咖啡色细胞悬液，消化过程中使用磁珠搅拌、温度维持在37°c）。所得细胞悬液经70um（200目）滤网过滤，并用4°c的hank''''s液冲洗降低消化酶作用。
将装有肝脏细胞悬液的硅化离心管25g离心5min，去除残余的肝实质细胞, 取上清液，400g离心10min，弃上清，沉淀物为富含肝脏非实质细胞的部分。用4°c的无血清dmem培养液冲冼重悬，定容至20 ml。取2只50 ml的刻度离心管，每管加入10 ml的30% percoll液，将细胞悬液缓慢铺在30% percoll液层上方，每管10 ml 30% percoll液 10 ml细胞混悬液，2500 rpm离心20 min。吸取中间细胞悬液层入50 ml刻度离心管，加入无血清dmem培养液至50 ml,1750 rpm离心8 min，取沉淀。加入预热37°c的含血清的dmem完全培养基至10 ml。（制备 percoll 密度梯度离心液， 自上而下密度分别为 1.037 g／ml （25%） 和 1.049 g／ml （35%）。 将沉淀用 rpmi-1640 培养基重悬后， 缓慢加入已经制备的 percoll 密度梯度离心液的最上层。2700 r／min， 4℃， 离心 20 min。 离心后， rpmi-1640 培养基与 20% percoll 密度层中间， 白色分层即为 hscs层 （图 1）。 用移液器吸咀小心吸取该层， 移至含抗生素的 rpmi-1640 培养基中，2 000r／min，4℃，离心 6 min。取沉淀与 rpmi-1640 培养基 （含 10%胎牛血清） 混匀制成细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞数。
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